Sâm Dây Kon Tum - Quy trình kỹ thuật nhân giống cây sâm dây bằng phương pháp nuôi cấy mô
- Thứ năm - 27/02/2014 15:16
- In ra
- Đóng cửa sổ này
Sâm dây hay còn gọi là Đảng sâm (Codonopsis sp.) là loại cây dược liệu có giá trị kinh tế. Đây là cây thuốc quý, có tác dụng bổ ngũ tạng, nâng cao thể lực, tăng sức dẻo dai, tăng cường khả năng miễn dịch cho cơ thể; có tác dụng ích huyết, sinh tân dịch, chống mệt mỏi, giảm stress. Bộ phận dùng làm thuốc duy nhất của Đảng sâm là rễ. Rễ cây Đảng sâm chứa saponins, triterpenes và steroid. Các hoạt chất có trong Đẳng Sâm giúp cho các hoạt động trao đổi chất của cơ thể tốt hơn.
Ở Việt Nam Đảng sâm mọc rải rác ở các tỉnh miền núi phía Bắc. Trước đây có nhiều ở một số tỉnh Lai Châu, Lào Cai, Hà Giang, Sơn La, Yên Bái, Tuyên Quang, Cao Bằng, Lạng Sơn. Các tỉnh phía Nam chỉ thấy tập trung ở cao nguyên Langbian (tỉnh Lâm Đồng) và xung quanh chân núi Ngọc Linh (Đắc Glây, Tu Mơ Rông, tỉnh Kon Tum và Quảng Nam - Đà Nẵng).
Tại Kon Tum, Sâm dây phân bố chủ yếu ở vùng Ngọc Linh thuộc huyện Tu Mơ Rông và Đăkglei. Do là loại cây dược liệu có giá trị kinh tế nên hiện nay người dân đang khai thác theo cách tận thu, dẫn đến ngày càng khan hiếm trong tự nhiên. Trong tương lai không xa, nguồn cây dược liệu mang tính đặt trưng của vùng sẽ có nguy cơ cạn kiệt. Vì vậy, chủ động sản xuất nguồn giống phục vụ cho sản xuất là vấn đề cấp thiết.
Từ kết quả nghiên cứu về nhân giống cây Sâm dây trong thời gian qua, chúng tôi đề xuất quy trình kỹ thuật nhân giống cây sâm dây bằng phương pháp nuôi cấy mô như sau:
1. Nuôi cấy tạo nguồn nguyên liệu ban đầu
- Chọn và xử lý mẫu
Chọn những đoạn thân cây Sâm dây non, sinh trưởng khỏe, không sâu bệnh làm vật liệu nuôi cấy để đưa vào ống nghiệm. Thân Sâm dây được cắt từng đoạn 3cm, bỏ lá. Ngâm các đoạn thân trong nước xà phòng loãng 10-15 phút, sau đó rửa dưới vòi nước chảy nhiều lần.
Tiếp tục ngâm các đoạn thân trong dung dịch thuốc nấm có chưa gốc đồng (COC 85) nồng độ 0,1% và được lắc 30 phút trên máy lắc, sau đó mẫu được rửa lại với nước cất 4-5 lần. Mẫu tiếp tục được khử khuẩn bằng kháng sinh Penixilin 1/1000 trong vòng 30 phút và lắc nhẹ. Sau đó rửa lại bằng nước cất 3-4 lần.
- Khử trùng mẫu
Thao tác này được tiến hành trong tủ cấy, trong điều kiện vô trùng. Mẫu sau khi được xử lý xong ta cho mẫu vào bình tam giác dung tích 250ml đã vô trùng và tiếp tục khử trùng với cồn 70% trong 30 giây, sau đó mẫu được rửa sạch bằng nước cất vô trùng 4-5 lần. Tiếp tục khử trùng kép với dung dịch HgCl2 trong khoảng thời gian khác nhau. Khử trùng lần 1 với HgCl2 0,1% trong thời gian 4 phút sau đó mẫu được rửa lại bằng nước cất vô trùng từ 4-5 lần và tiếp tục khử lần 2 với HgCl2 0,1% trong 1 phút và mẫu được rửa lại với nước cất vô trùng 5 lần. Khi này mẫu cấy đã được khử trùng xong, dùng dao cấy vô trùng cắt thành đoạn dài 1-2cm, cắt dọc theo đoạn thân và đặt lên môi trường vô trùng đã chuẩn bị sẵn.
- Môi trường nuôi cấy khởi động
Môi trường MS (Murashigan Skoog, 1962) có bổ sung TDZ: 0,1 mg/lit; 2,4D: 2 mg/lit; Agar: 8 g/lit; đường: 30 g/lit. (pH 5,7-5,8)
Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ phòng: 25 ± 20c; Cường độ ánh sáng: 2.000 – 2.500 lux; thời gian chiếu sáng: 10 giờ/ngày.
Sau khoảng 3-4 tuần mẫu cấy bắt đầu xuất hiện callus, đến khoảng 60 ngày thì ta chuyển sang môi trường nhân nhanh callus.
2. Nhân nhanh callus
Mẫu callus được tạo thành từ quá trình nuôi cấy khởi động được cắt thành từng khối nhỏ cấy vào môi trường MS1/2 có bổ sung TDZ: 0,1 mg/lit; 2,4D: 2 mg/lit; Agar: 9,5g/lit; than hoạt tính: 1g/lit; đường: 30 g/lit. Sau 8 tuần ta tiếp tục chuyển sang môi trường tương tự để nhân callus đến khi đủ số lượng theo yêu cầu.
3. Nuôi cấy tạo chồi
Mẫu callus Sâm dây được sử dụng làm nguyên liệu cho quá trình tạo chồi. Các callus được cắt thành từng mẫu có đường kính 5 mm, được cấy vào môi trường MS có bổ sung BA: 2 mg/lit; NAA: 0,5 mg/lit; Agar: 9,5 g/lit; Đường: 30 g/lit (pH 5,7-5,8). Sau khi cấy khoảng 60 ngày, các callus sẽ phát sinh chồi. Chồi này được sử dụng làm nguyên liệu cho quá trinh nhân nhanh.
4. Nhân cụm chồi
Các cụm chồi tạo thành từ giai đoạn tạo chồi được cắt thành các cụm nhỏ có đường kính khoảng 5 mm, có từ 3 – 5 chồi, cấy lên môi trường MS có bổ sung BA: 2 mg/lit; NAA: 0,5 mg/lit; Agar: 9,5 g/lit; đường: 30 g/lit; than hoạt tính: 1 g/lit (pH: 5,7 – 5,8). Sau khoảng 40 ngày từ các cụm chồi ban đầu sẽ hình thành nhiều chồi mới, khi các chồi Sâm dây dài ra và nhân lên với số lượng nhiều ta cắt chuyển sang môi trường ra rễ để tạo cây hoàn chỉnh.
5. Tạo cây Sâm dây In vitro
Các chồi được được cắt thành từng đoạn ngắn khoảng 1 cm, có chứa 1 mắt và 1 cặp lá, được cấy vào môi trường MS có bổ sung BA: 0,5 mg/lit; IBA: 0,7 mg/lit; Agar: 9,5 g/lit; đường: 15 g/lit; than hoạt tính: 1 g/lit (pH: 5,7 – 5,8).
Sau khoảng 10-15 ngày cây Sâm dây đã có 4-5 cặp lá, 6 – 10 rễ, chiều dài 4– 6 cm là ta có thể đưa ra vườn ươm.
6. Chăm sóc cây vườn ươm
a/ Chuẩn bị giá thể, chuyển cây
Cây Sâm nuôi cấy mô được lấy ra khỏi bình, rửa sạch agar trong chậu nước, vớt ra để ráo (các thao tác phải thật nhẹ nhàng). Rồi trồng lên giá thể chuẩn bị sẵn. Giá thể gồm 2 loại:
- Giá thể 1 : Dùng cho giai đoạn đầu từ khi bắt đầu chuyển cây từ bình cấy mô. Giá thể là cát rửa sạch, cho vào các khay.
- Giá thể 2: Dùng cho giai đoạn sau khi cây cấy mô đã trồng trên giá thể 1. Thành phần giá thể bao gồm đất thịt nhẹ: xơ dừa đã xử lý: phân chuồng hoai theo tỷ lệ 2: 2: 1, bổ sung 5% NPK (16:16:8) và 2% vôi bột. Giá thể phải được ủ và đảo trước khi gieo trồng ít nhất là 3 tháng. Sau đó ta đóng giá thể vào bầu hoặc các vỉ xốp.
Sau khi trồng 4 tuần trên giá thể 1, cây Sâm dây bắt đầu thích nghi với môi trường bên ngoài, phát triển ổn định ta tiến hành chuyển cây trồng lên giá thể 2.
b/ Chăm sóc:
Định kỳ mỗi ngày tưới phun sương một lần, sau 10 ngày chăm sóc cây đã phát triển ta có thể phun dung dịch NPK (20 – 20 – 15) với nồng độ 0,5g/l mỗi tuần tưới một lần. Sau 8 tuần lúc đó cây Sâm dây có khoảng 5 - 6 cặp lá, chiều cao 18 – 20cm ta có thể đưa cây ra trồng ngoài thực địa. /.
Tại Kon Tum, Sâm dây phân bố chủ yếu ở vùng Ngọc Linh thuộc huyện Tu Mơ Rông và Đăkglei. Do là loại cây dược liệu có giá trị kinh tế nên hiện nay người dân đang khai thác theo cách tận thu, dẫn đến ngày càng khan hiếm trong tự nhiên. Trong tương lai không xa, nguồn cây dược liệu mang tính đặt trưng của vùng sẽ có nguy cơ cạn kiệt. Vì vậy, chủ động sản xuất nguồn giống phục vụ cho sản xuất là vấn đề cấp thiết.
Từ kết quả nghiên cứu về nhân giống cây Sâm dây trong thời gian qua, chúng tôi đề xuất quy trình kỹ thuật nhân giống cây sâm dây bằng phương pháp nuôi cấy mô như sau:
1. Nuôi cấy tạo nguồn nguyên liệu ban đầu
- Chọn và xử lý mẫu
Chọn những đoạn thân cây Sâm dây non, sinh trưởng khỏe, không sâu bệnh làm vật liệu nuôi cấy để đưa vào ống nghiệm. Thân Sâm dây được cắt từng đoạn 3cm, bỏ lá. Ngâm các đoạn thân trong nước xà phòng loãng 10-15 phút, sau đó rửa dưới vòi nước chảy nhiều lần.
Tiếp tục ngâm các đoạn thân trong dung dịch thuốc nấm có chưa gốc đồng (COC 85) nồng độ 0,1% và được lắc 30 phút trên máy lắc, sau đó mẫu được rửa lại với nước cất 4-5 lần. Mẫu tiếp tục được khử khuẩn bằng kháng sinh Penixilin 1/1000 trong vòng 30 phút và lắc nhẹ. Sau đó rửa lại bằng nước cất 3-4 lần.
- Khử trùng mẫu
Thao tác này được tiến hành trong tủ cấy, trong điều kiện vô trùng. Mẫu sau khi được xử lý xong ta cho mẫu vào bình tam giác dung tích 250ml đã vô trùng và tiếp tục khử trùng với cồn 70% trong 30 giây, sau đó mẫu được rửa sạch bằng nước cất vô trùng 4-5 lần. Tiếp tục khử trùng kép với dung dịch HgCl2 trong khoảng thời gian khác nhau. Khử trùng lần 1 với HgCl2 0,1% trong thời gian 4 phút sau đó mẫu được rửa lại bằng nước cất vô trùng từ 4-5 lần và tiếp tục khử lần 2 với HgCl2 0,1% trong 1 phút và mẫu được rửa lại với nước cất vô trùng 5 lần. Khi này mẫu cấy đã được khử trùng xong, dùng dao cấy vô trùng cắt thành đoạn dài 1-2cm, cắt dọc theo đoạn thân và đặt lên môi trường vô trùng đã chuẩn bị sẵn.
- Môi trường nuôi cấy khởi động
Môi trường MS (Murashigan Skoog, 1962) có bổ sung TDZ: 0,1 mg/lit; 2,4D: 2 mg/lit; Agar: 8 g/lit; đường: 30 g/lit. (pH 5,7-5,8)
Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ phòng: 25 ± 20c; Cường độ ánh sáng: 2.000 – 2.500 lux; thời gian chiếu sáng: 10 giờ/ngày.
Sau khoảng 3-4 tuần mẫu cấy bắt đầu xuất hiện callus, đến khoảng 60 ngày thì ta chuyển sang môi trường nhân nhanh callus.
2. Nhân nhanh callus
Mẫu callus được tạo thành từ quá trình nuôi cấy khởi động được cắt thành từng khối nhỏ cấy vào môi trường MS1/2 có bổ sung TDZ: 0,1 mg/lit; 2,4D: 2 mg/lit; Agar: 9,5g/lit; than hoạt tính: 1g/lit; đường: 30 g/lit. Sau 8 tuần ta tiếp tục chuyển sang môi trường tương tự để nhân callus đến khi đủ số lượng theo yêu cầu.
3. Nuôi cấy tạo chồi
Mẫu callus Sâm dây được sử dụng làm nguyên liệu cho quá trình tạo chồi. Các callus được cắt thành từng mẫu có đường kính 5 mm, được cấy vào môi trường MS có bổ sung BA: 2 mg/lit; NAA: 0,5 mg/lit; Agar: 9,5 g/lit; Đường: 30 g/lit (pH 5,7-5,8). Sau khi cấy khoảng 60 ngày, các callus sẽ phát sinh chồi. Chồi này được sử dụng làm nguyên liệu cho quá trinh nhân nhanh.
4. Nhân cụm chồi
Các cụm chồi tạo thành từ giai đoạn tạo chồi được cắt thành các cụm nhỏ có đường kính khoảng 5 mm, có từ 3 – 5 chồi, cấy lên môi trường MS có bổ sung BA: 2 mg/lit; NAA: 0,5 mg/lit; Agar: 9,5 g/lit; đường: 30 g/lit; than hoạt tính: 1 g/lit (pH: 5,7 – 5,8). Sau khoảng 40 ngày từ các cụm chồi ban đầu sẽ hình thành nhiều chồi mới, khi các chồi Sâm dây dài ra và nhân lên với số lượng nhiều ta cắt chuyển sang môi trường ra rễ để tạo cây hoàn chỉnh.
5. Tạo cây Sâm dây In vitro
Các chồi được được cắt thành từng đoạn ngắn khoảng 1 cm, có chứa 1 mắt và 1 cặp lá, được cấy vào môi trường MS có bổ sung BA: 0,5 mg/lit; IBA: 0,7 mg/lit; Agar: 9,5 g/lit; đường: 15 g/lit; than hoạt tính: 1 g/lit (pH: 5,7 – 5,8).
Sau khoảng 10-15 ngày cây Sâm dây đã có 4-5 cặp lá, 6 – 10 rễ, chiều dài 4– 6 cm là ta có thể đưa ra vườn ươm.
6. Chăm sóc cây vườn ươm
a/ Chuẩn bị giá thể, chuyển cây
Cây Sâm nuôi cấy mô được lấy ra khỏi bình, rửa sạch agar trong chậu nước, vớt ra để ráo (các thao tác phải thật nhẹ nhàng). Rồi trồng lên giá thể chuẩn bị sẵn. Giá thể gồm 2 loại:
- Giá thể 1 : Dùng cho giai đoạn đầu từ khi bắt đầu chuyển cây từ bình cấy mô. Giá thể là cát rửa sạch, cho vào các khay.
- Giá thể 2: Dùng cho giai đoạn sau khi cây cấy mô đã trồng trên giá thể 1. Thành phần giá thể bao gồm đất thịt nhẹ: xơ dừa đã xử lý: phân chuồng hoai theo tỷ lệ 2: 2: 1, bổ sung 5% NPK (16:16:8) và 2% vôi bột. Giá thể phải được ủ và đảo trước khi gieo trồng ít nhất là 3 tháng. Sau đó ta đóng giá thể vào bầu hoặc các vỉ xốp.
Sau khi trồng 4 tuần trên giá thể 1, cây Sâm dây bắt đầu thích nghi với môi trường bên ngoài, phát triển ổn định ta tiến hành chuyển cây trồng lên giá thể 2.
b/ Chăm sóc:
Định kỳ mỗi ngày tưới phun sương một lần, sau 10 ngày chăm sóc cây đã phát triển ta có thể phun dung dịch NPK (20 – 20 – 15) với nồng độ 0,5g/l mỗi tuần tưới một lần. Sau 8 tuần lúc đó cây Sâm dây có khoảng 5 - 6 cặp lá, chiều cao 18 – 20cm ta có thể đưa cây ra trồng ngoài thực địa. /.
